『壹』 質粒轉化步驟
質粒的轉化，滿滿干貨
原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理後，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。
感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處於容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。
質粒的轉化主要包含
Ⅰ感受態細胞制備
Ⅱ質粒DNA轉化
Ⅲ質粒DNA的提取
（Ⅰ）感受態細胞制備
1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種於3ml LB培養基的試管中，37℃振盪培養過夜。
2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振盪擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。
3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。
4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除干凈。
5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉澱細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）
6）4℃離心10min（4000r/min）。
7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞製成。
8）可直接用於實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。
（Ⅱ）質粒DNA的轉化
1）取100ul新鮮制備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。
冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最後一點冰融化後，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高於0℃，會降低轉化效率。
2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短於30min ,可能影響轉化率。然後迅速冰浴2min。
3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振盪培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對於細胞恢復和抗生素抗葯性表達具有最佳效果。
4）取適當（50ul）的復甦細胞培養液，塗布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恆溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收後，倒置培養皿，在37℃恆溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。
5）菌落結果：
① 無菌落
失敗或者培養條件不充分
② 布滿菌落,
呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由於黴菌污染所致
③ 布滿菌落
濃度太高，失敗
④ 出現菌落
符合要求
Ⅲ）質粒DNA的提取
質粒DNA的提取，由於其本身分子量小，一般採用鹼裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對於其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。
各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：
A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在裡面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩沖液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉澱時間。
B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過鹼溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與後期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關系。此步驟中需要注意的是，鹼溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致鹼破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成污染。
C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的鹼性物質，並去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。
D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多餘的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之後，需要用wash buffer 洗脫掉多餘的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對後續酶切和測序反應會有影響，因此在後續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。
E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫硅膠柱上的DNA樣品。
1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。
2.細胞收獲：對於高拷貝質粒（培養液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對於低拷貝質粒（培養液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。
3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，並使其混勻。
4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之後在室溫下放置5min.
5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理後，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是採用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。
6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。
7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液
8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出裡面的液體。
9. 質粒DNA沉澱：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之後風干10分鍾
10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。
重組質粒鑒定的方法：
① 雙酶切後跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然後電泳。
③ 送公司測序（最為准確的鑒定方式）。
影響轉化效率的因素：
① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存於-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存於4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。
② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度范圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。
③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。
④防止雜菌和DNA污染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，並防止在實驗過程中引入其他污染。
⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束後可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低於6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關系。
幾種擴增常用感受態細胞：
① 普通骨架載體cDNA產品
DH5α：常用於質粒克隆，可用於藍白斑篩選
TOP10：適用於高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。
TG1: 生長速度快，常用於噬菌體的制備，同時也可用於普通質粒的構建。
CopyCutter：適用於有毒克隆。
② 慢病毒載體質粒：
Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重復區的重組，降低錯誤重組的概率
Stable（NEB）：可用於逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。
『貳』 重組質粒 DNA 的轉化實驗時為什麼先正置,後倒置
正置的原因是你本來塗板抹開了，但是你沒有抹乾，如果直接倒置會引起一體流動，結果你會發現，一大堆菌落擠在一起，你沒有辦法挑單克隆，你會痛不欲生的。在烘箱中正置30分鍾是為了烘乾液體，防止上述情況發生。而倒置是為了防止，細菌由於重力作用向培養基裡面發展而非向上發展哦~
『叄』 關於重組質粒轉化的問題
可能是特定的熱穩定DNA聚合酶作用的最適溫度及時間吧。擾動轉化體系的話，可能由於解鏈與復性過程中DNA分子的不穩定，會導致拷貝擴曾出現異常吧。
『肆』 微生物的擴大培養為什麼要得到由單個細胞繁殖而來的菌落呢
有時單菌落很多次，你可以從單細胞繁殖，它必須重復分離純種的方法有很多你第一次面臨著非常全面的，可以看看。
微生物實驗室分離純化方法日期:2010-03-01瀏覽次數：18
混合微生物種群僅包含某一種或一個微生物過程稱為微生物的分離和純化。在分子生物學的研究和應用，不僅
只包含一個特定的方法或微生物的過程稱為微生物的分離和純化，混合微生物種群中分離。在分子生物學的研究和應用，不僅通過混合的天然微生物的分離和純化技術分離出特定的微生物，但也一定要注意保持微生物純培養物的「純潔」，以防止其他微生物的污染。
1，與固體培養基中分離和純化
單個微生物的合適的固體介質的表面或內部生長，繁殖，在一定程度上，可以形成可見的，是一個一定的形態結構的子細胞生長組稱為菌落。即使當表面的固體培養基許多菌落到細菌的草坪成為此。不同的微生物的生長和形成的菌落在一個特定的介質或細菌草坪通常有穩定的特點，可以成為微生物的分類和鑒定的重要依據。大多數細菌，酵母，以及許多真菌和單細胞藻類，形成孤立的固體培養基上的菌落，用一個合適的片劑分離方法是很容易獲得的純培養。所謂的平面，即培養板中提到的，它是指在固體培養基倒入無菌的陪替氏培養皿中，並冷卻和固化後，盛固體培養基平板。此方法包括一個單一的分離微生物，並固定在固體培養基的表面或內部的。固體培養基凝固與瓊脂凝膠材料中，每一個獨立的活微生物的生長，繁殖，形成菌落，菌落形成可移植的。最常見的分離，培養的微生物瓊脂固體培養基上是一個堅實的中小板。容易被科克成立100多年來，一直是最常見的手段的不同菌株板分離微生物純培養。
1.1稀釋倒平板法
第一個微生物懸浮液了一系列的稀釋（如1:10,1:100,1:1000,1:10000），然後稀釋劑一點，並已熔化和瓊脂培養基冷卻至50℃或約混合，振搖後，傾入消毒的陪替氏培養皿，直到在瓊脂凝固後，使細菌的瓊脂平板中，並培養一定的時間，可能會出現的菌落。如果稀釋適當地在平坦的表面上出現或瓊脂培養基中，可以分散的單個菌落，菌落可能傳播由細菌細胞中，就形成了。然後挑取單個菌落，或重復以上操作數次，就可以得到一個純粹的文化。
1.2擴展板的方法可以很容易地導致死亡的一些熱敏感的菌株，並利用微生物懸浮液加入熱介質，然後倒平板電腦也導致一些稀釋倒平板法嚴格的需氧細菌缺乏氧氣由於固定在瓊脂中間影響其生長，因此純種的分離方法是微生物學研究的擴散板方法中使用。其做法是第一熔融培養基傾入無菌的陪替氏培養皿中，以制備無菌的片劑，冷卻和固化後，一定量的微生物的懸浮液逐滴加入到在平板表面，然後作為一個無菌玻璃從整個板的表面均勻地分散塗布棒桿菌，拾取單個菌落培養後（圖1）。
圖1擴展板的方法
1.3平板劃線法
最簡單的方法分離的微生物平板劃線法，即接種環無菌精選小料要分開的連續劃線無菌平坦面（圖2），微生物細胞的數目將減少與劃線的數目增加，並且逐漸分散，如果越過如果合適，該微生物可以11分散後的培訓，上述平面板的表面上，得到單菌落。有時單菌落，它必須重復多次，然後才能得到純種分離的單細胞繁殖。其原理是，微生物的樣品多次的固體培養基的表面達到分離的目的，從點到線「稀釋」。劃線的方法很多，常見的容易出現的單菌落劃線的斜杠法曲線法，網格法，輻射，四格的方法。
圖2平板劃線法
1.4稀釋搖管
固體培養基分離嚴格厭氧菌的特殊性，，如果機體暴露在空氣中立即死亡，可以准備通常的方法平板，然後放置在一個封閉的容器中培養，並在容器中的氧氣可以是化學，物理或生物的方法來清除。對於那些誰是更敏感的氧厭氧微生物純培養，分離培養法都不能動搖稀釋管，它是另一種形式的稀釋傾注法。管加熱的第一串聯盛無菌瓊脂培養基瓊脂熔化後，冷卻並維持在50℃左右，梯度稀釋的材料，可以與這些管分離，管快速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂表面傾倒滅菌的液體石蠟和固體石蠟，介質和空氣的混合物的柱層被分離。培養後，形成的菌落在瓊脂上在中間的列。挑取單菌落，移植，需要使用無菌針頭蓋和用毛細管插入瓊脂和它們之間的壁進入無菌無氧氣體中除去液體石蠟 - 石蠟，瓊脂柱吸出，放置在陪替氏菜用無菌刀瓊脂柱切成薄片觀察和殖民地移植。
2，用液體培養基中分離和純化
大多數細菌和真菌分離使用的板方法通常是令人滿意的，因為它們是在固體介質中的大多數物種上看起來很不錯。然而，迄今為止，不是所有的微生物，可以在固體培養基上生長，例如，一些大的細菌的細胞，許多原生動物和藻類等，這些微生物需要使用液體介質中分離，得到的純培養。使用液體培養基中分離和純化的
稀釋法。在液體培養基中，接種物的順序稀釋以獲得高程度的稀釋效應，少於一個微生物是在試管中分配。大多數的管子，如果稀釋後沒有微生物的生長，並在體外培養中得到的微生物的生長可能然後有一個純培養。稀釋後管的比例將大幅增加微生物的生長，獲得純培養的降水。因此，稀釋法，固液分離，必須在許多平行試管稀釋，大部分（一般應不超過95％）表明沒有增長。
3，
分離的單細胞（孢子）只能從該總數的類型的混合微生物種群的優點是被隔離的稀釋方法的一個重要的缺點。在自然界中，許多微生物在混合組是少數。在這種情況下，您可以採取的顯微切割法直接分離細胞或單個個體進行培養，獲得純培養物，被稱為單細胞（或單孢子）分離方法，從一個混居的。單細胞分離難度和細胞或個人的大小成反比，較大的微生物，如藻類，原生動物更容易，個別的小細菌是困難得多。的
較大的微生物，可以使用毛細管提取單個個體，並在大量的滅菌介質轉印洗滌數次除去較小的微生物污染。此操作可以在低倍率的顯微鏡進行，如在解剖顯微鏡下。相對小的單個微生物，需要在顯微鏡下使用顯微操作使用毛細管或微觀的針，鉤，環拾取一個單一的微生物細胞或孢子，得到純培養。在顯微鏡下的顯微操作在沒有單細胞分離，也有一些替代的方法可以使用??，例如，可以通過適當稀釋的樣品制備後成小液滴，在顯微鏡下觀察到的，並只選擇一個單元格含有液體純培養分離。分離的單細胞操作技術有更高的要求，使用大多限於高度專業化的科研。分離
4，選擇培養的培養基或培養條件沒有能夠滿足所有的微生物的生長的需要，所有的培養基中選擇在一定程度上性質。如果在某種微生物的生長需要是已知的，可以設計適合於該微生物的生長的特定的環境，從而能夠以該微生物選自混合微生物種群進行培養，雖然在混合微生物種群種微生物可能是是少數。等的分離，在被稱為選擇培養分離，特別是適合於從自然界分離的，找到有用的微生物的微生物的純培養的技術通過選擇培養。自然，在大多數場合中的微生物群落是由各種各樣的微生物，分離所需的特定的微生物是非常困難的，尤其是當存在時相比，以非常小的其他微生物的量和一定的微生物種，單用途板在一般的稀釋方法幾乎是不可能的。這種微生物的分離，必須基於的特性的微生物，包括營養，生理，生長條件，培養菌株。或抑制大多數微生物不能生長，或造成這種微生物的成長環境，有利於社區的數量的增加，因此，在一定的時間來培養板稀釋的純培養??分離細菌。
4.1使用在選擇平板
直接分離，根據被分離微生物功能選擇不同的培養條件下，也有各種方法可以使用??。要分開，例如，嗜熱菌，可以在高溫條件下培養;分離某些抗生素的耐葯菌株，並用抗生素，可以分離成板，一些微生物，如螺旋體，粘細菌，藍藻等在的瓊脂平板的表面。或的士車廂內，他們可以利用的滑動特性的分離和純化，因為滑行可以讓自己和其他微生物不能單獨移動。板的微生物群落，使微生物在跑道上滑行滑行前挑接種反復進行，以獲得一個純粹的文化。
4.2富集培養
富集培養的原則和方法是很簡單的，不同利用不同的微生物的生命活動的特點，制定具體的環境條件下，唯一的條件相適應的微生物強勁的增長，它在社會上，可以很容易地分離到所需的特定微生物數量大大增加。富集條件可以根據需要分離的物理，化學，生物，和集成的許多方面，如溫度，pH，紫外線，高的壓力，光，氧氣，營養等許多方面的微生物的特性選擇。在相同的培養基和培養條件下，它是容易反復移位的物種的菌株後，在固體培養基上生長，並最終濃縮的單個菌落。如果你想分開一段寄生菌的樣品接種到相應敏感宿主細胞群體，有很大的增長。通過反復移動的物種可以得到純寄生菌。
5，二元文化
分離，得到純培養的目的。然而，在某些情況下，這是很難做到的。但可用的二進制文化作為替代品的純化和培養。文化包含兩個或更多種微生物混合培養作為一個已知的，並僅含有2種微生物的培養，但也有是同時保持意識文化稱為二進制文化之間的特定關系。如二進制文化是最有效的方式來保存病毒，因為病毒是細胞生物的嚴格細胞內寄生。有些細胞和微生物也有嚴格的生物細胞內寄生物，或特殊的共生關系。這些微生物，二元文化是最接近的純培養物的培養方法，在控制的條件下，可以在實驗室中實現。此外，原生動物大鱷微小的微生物很容易在實驗室培養的方法與雙文化，文化的微生物原生動物和狩獵。例如，纖毛蟲，變形蟲和粘菌。
幾種方法如上所述，平板分離方法一般用於實驗室微生物的分離和純化。在固體培養基上的單個菌落的微生物的生長和形成，通常是由一個細胞組件製成的復製品。單菌落被選中，並獲得一個純粹的文化。可以通過稀釋塗布平板或板裸奔技術的方法，以獲得單個菌落。值得注意的是，通過在平板上生長的單個菌落，分離從微生物種群不一定可以保證的純培養。因此，純文化的決心，除了觀察菌落特徵，但也與顯微鏡檢查，以確定個體的形態特徵，一些純培養的微生物通過一系列的分離和純化過程，以及各種特性，以獲得。
『伍』 重組質粒的連接、轉化及篩選實驗方法的實踐誰能總結一下，我寫生物論文需要了解一下這方面的知識
生物幫，依託互聯網，在注重科學性、實用性和權威性的前提下，面向生物研究者、企業和研究機構，提供最新、領先、精準、高效、全面的生物產品和技術信息。樓主可以去那裡查看一下啊。 [實驗要點總結]1、DNA連接酶用量與DNA片段的性質有關，連接平齊末端，必須加大酶量，一般使用連接粘性末端酶量的10-100倍。2、在連接帶有粘性末端的DNA片段時，DNA濃度一般為2-10mg/ml，在連接平齊末端時，需加入DNA濃度至100-200mg/ml。3、連接反應後，反應液在0℃儲存數天，-80℃儲存2個月，但是在-20℃冰凍保存將會降低轉化效率。4、粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應溫度為37℃，在連接粘性末端時，反應溫度以10-16℃為好，平齊末端則以15-20℃為好。5、在連接反應中，如不對載體分子進行去5'磷酸基處理，便用過量的外源DNA片段(2-5倍)，這將有助於減少載體的自身環化，增加外源DNA和載體連接的機會。6、LB選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當抗生素時，攜有載體DNA的轉化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落。該產品篩選效果同藍白斑篩選，且價格低廉。但需及時挑取白色菌落，當培養時間延長，白色菌落會逐漸變成微紅色，影響挑選。7、X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-galactosidase)水解後生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導物，它可以誘導lacZ的表達。8、在含有X-gal和IPTG的篩選培養基上，攜帶載體DNA的轉化子為藍色菌落，而攜帶插入片段的重組質粒轉化子為白色菌落，平板如在37℃培養後放於冰箱3-4小時可使顯色反應充分，藍色菌落明顯。 如果有空的話可以去生物幫（ MALINGS.www.bio1000.com/ ）那裡看下，實驗的步驟，細節，以及注意事項，都有介紹的
『陸』 基因工程中重組質粒怎麼形成
在基因工程中，通常是把外源DN***斷利用運載工具送入生物細胞。攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫做載體(Vector)。
載體的本質是DNA。經過人工構建的載體，不但能與外源基因相連接，導入受體細胞，還能利用本身的調控系統，使外源基因在新細胞中復制以致功能的表達。目前，將外源基因運送到原核生物細胞的載體研究的較多，運送到植物和動物細胞中去的載體還處於探索階段。本章以原核細胞載體為主，討論各類載體的結構、功能以及構建過程。
在基因工程中所用的載體，主要有5類，
(1) 質粒(Plasmid)，主要指人工構建的質粒。
(2) 噬菌體的衍生物。
(3) cosmid(柯斯質粒)。
(4) 單鏈DNA噬菌體M13。
(5) 動物病毒。
各類載體的來源不同，在大小、結構、復制等方面的特性差別很大，但作為基因工程用的載體，以下三方面是它們共有的特性和基本要求： (1)在宿主細胞中能獨立自主的復制，即本身是復制子。(2)容易從宿主細胞中分離純化。(3)載體DNA分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，插在其中的外源基因可以象載體的正常組分一樣進行復制和擴增。各類載體具有自己獨特的生物學特性，可以根據基因工程的需要，有目的的選擇合適的載體，為此，分別介紹各類載體。
一、質粒載體
質粒是一種裸露的，比病毒更簡單的，有自主復制能力的DNA分子，是處於生命與非生命的分界線
(一) 質粒的一般生物學特性
質粒（plasmid)是染色體以外能自主復制的雙鏈閉合環狀DNA分子，它廣泛存在於細菌細胞中。在黴菌、藍藻、酵母和不少動植物細胞中也發現有質粒存在。目前對細菌質粒研究的較為深入，在基因工程中，多使用大腸桿菌質粒為載體。質粒分子的大小為1—200kb，質粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，沒有外殼蛋白，在基因組中，也沒有溶菌酶基因。質粒可以『友好」的「借居」在宿主細胞中，也只有在宿主細胞中，質粒才能完成自己的復制。同時將其編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進行表達，賦予宿主細胞各種有利的表型。
1．質粒的類型
在大腸桿菌中現已找到許多類型的質粒，其中對F質粒，R質粒和Col質粒研究的較為清楚。由於這些質粒的存在，寄主細胞獲得了各自不同的性狀特徵。簡介如下：
F質粒：又叫F因子或性質粒(sex plasmid)。 F因子是雄性決定因子，所以F+細胞又叫雄性細胞，與此相應的F—細胞則叫做雌性細胞。F+細胞的表面可以形成一種叫做性須(pilus)的結構，它促進雄性細胞同雌性細胞進行配對。在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養，由於性須的作用，就會形成雌—雄細胞配對。我們稱這種過程為細菌的接合作用(conjugation)。在雌雄細胞配對期間，雄性細胞中的F因子按滾環復制模式，經性須作用進入到雌性細胞。配對之後F—受體細胞獲得了F因子，也變成為F+細胞。
F因子不但能夠通過接合作用實現自我轉移，而且還能夠帶動寄主染色體一道轉移。由F因子整合到染色體而成的Hfr細胞（高頻重組細胞），就有可能引發寄主染色體發生高頻轉移。但F因子的這種整合作用是一種可逆的過程，因此在一定的條件下，Hfr細胞又可重新變成F+或F細胞。
R質粒：也稱抗葯性因子。R質粒編碼一種或數種抗菌素抗性基因，此種抗性通常能轉移到缺乏該質粒的受體細胞，使後者也獲得同樣的抗菌素抗性能力
Col質粒：此類質粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產生大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種毒性蛋白，它可以使不帶Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死。
根據質粒DNA中是否含有接合轉移基因，可以分成兩大類群:即接合型質粒和非接合型質粒。接合型質粒亦稱自我轉移的質粒，這類質粒除含有自我復制基因外，還帶有一套控制細菌配對和質粒接合轉移的基因，如F質粒，部分R質粒和部分Col質粒。非接合型質粒亦稱不能自我轉移的質粒，此類質粒能夠自我復制，但不含轉移基因組，因此這類質粒不能從一個細胞自我轉移到另一個細胞。從基因工程的安全形度講，非接合型質粒用作克隆載體更為合適。
2．質粒的復制類型
一種質粒在一個細胞中存在的數目，稱為質粒的拷貝數。根據宿主細胞所含拷貝數的多少，可把質粒分成兩種不同的復制型。一種是低拷貝數的質粒，稱「嚴緊型」復制控制的質粒(stringent plasmid)，此類質粒每個宿主細胞僅含1～3份的拷貝。另一類是高拷貝數的「鬆弛型」復制控制的質粒(relaxed plasmid)，這類質粒每個宿主細胞可達到10～60份拷貝。
一種質粒究竟是屬於嚴緊型還是鬆弛型並不是絕對的，這往往同宿主的狀況有關。同一質粒在不同的宿主細胞中可能具有不同的復制型，這說明質粒的復制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制。
在一般情況下，質粒的接合轉移能力與復制型及分子大小間有一定的相關性。現歸納如下：
分子量大 分子量小
接合型質粒 拷貝數少 非接合型質粒 拷貝數多
嚴緊型復制 鬆弛型復制
3．質粒的不親和性
在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一宿主細胞中穩定地共存，這一現象稱為質粒的不親和性(plasmid incompatibility)，也稱不相容性。例如colEI派生質粒，它們之間是互不相容的，也就是說，這些親緣關系較近的不同質粒，當兩種進入同一細胞後，必定有一種在細胞的增殖過程中，被逐漸排斥(稀釋)掉。稱這些質粒間是不相容的。
彼此不相容的質粒屬於同一個不親和群Gneompatiblity group)。而彼此能夠共存的親和質粒，則屬於不同的不親和群。大腸桿菌質粒現已鑒別出25個以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個不親和群內的質粒是不相容的。
(二) 質粒載體的基本條件
以上討論的都是天然質粒，天然質粒的研究在理論上和遺傳學等方面作出了貢獻，但它很難直接作為基因工程的運載體應用。質粒載體絕大多數是以天然質粒為基礎，人工改造和組建形成的實用載體。可根據不同的實驗要求，加以選擇。
作為理想的質粒載體，應具備以下幾個條件：
(1) 能自主復制，即本身是復制子
(2) 具有一種或多種限制酶的單一切割位點，並在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復制功能；
(3) 在基因組中有1—2個篩選標記，為寄主細胞提供易於檢測的表型特徵。
(4) 分子量要小，多拷貝，易於操作。
二、 大腸桿菌質粒載體
1．pBR322質粒
質粒pBR322是經人工構建的一種較為理想的大腸桿菌質粒載體，亦是應用最為廣泛的克隆載體，利用pBR322曾克隆到多種基因，雖然現在已有多種具有更優良特性的新型克隆載體逐漸代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工構建的具有幾乎所有的理想特性的基因克隆載體之一。pBR322質粒是按照標準的質粒載體命名法則命名的。「p」表示它是一種質粒；而「BR」則是分別取自該質粒的兩位主要構建者F．Bo1ivar和R．L．Rodriguez姓氏的頭一個字母，「322'』系指實驗室編號，以與其他質粒載體如pBR325，pBR327，pBR328等相區別。當然，「BR"恰好與「細菌抗葯性」(bacterialresistance)兩個詞的第一個字母等同，所以有不少人認為pBR322中的"pBR"是「細菌抗葯性質粒」的英文縮寫。這顯然是一種容易使人信以為真的猜想，而事實上只是一種有趣的巧合。
（1）pBR322質粒的結構
pBR322的圖譜:
從pBR322質粒的構建過程，可以知道它是由三個不同來源的部分組成的，
第一部分來源於pSF2124質粒易位子Tn3的氨苄青黴素抗性基因（ampr）；
第二部分來源於pSC101質粒的四環素抗性基因（tetr）；
第三部分來源於ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。
（2）pBR322質粒載體的優點
pBR322質粒載體的第一個優點是具有較小的分子量。為了方便起見，大家統一規定pBR322質粒DNA分子核苷酸的計數從EcoRI限制酶的識別位點開始，並公認該序列…GAATTC…中的第一個T為核苷酸1(圖4—23)，然後沿著從tetr基因到ampr基因按順時針方向順序計數。因此pBR322質粒DNA分子的正確長度是4 363bp。
pBR322質粒載體的第二個優點是，具有兩種抗菌素抗性基因可供作掛化子的選擇記號。現在已知總共有24種核酸內切限制酶對pBR322DNA分子都只具有單一的識別位點。其中有7種限制酶：EcoRV, NheI, BamHI, SphI, SalI, XmaIII和NruI，它們的識別位點是位於四環素抗性基因內部，另外有2種限制酶:ClaI和HindIII的識別位點是存在於這個基因的啟動區內，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr基因的失活；還有3種限制酶(ScaI、PvuI和PstI)在氨苄青黴素抗性基因（ampr）內具有單一的識別位點，在這個位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。這種因DNA插入而導致基因失活的現象，稱之為插入失活效應。
質粒DNA編碼的抗菌素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質粒的一種十分有用的方法。例如，將外源DN***段克隆在pBR322質粒的BamHI或SalI位點上，由於阻斷了tetr基因編碼序列的連續性，而使其失去活性，結果便產生出了具有AmprTetr表型的重組的pBR322質粒。將這樣的重組質粒轉化給野生型(AmpSTetr)的大腸桿菌細胞，並塗布在含有氨苄青黴素的選擇性培養基平板上。那麼存活下來的菌落都將具有Ampr的表型，因此它們也必定是獲得了編碼有這種抗性基因的質粒的轉化子克隆。但在這些Ampr表型的轉化子克隆中，有一部分具有Tetr表型，另一部分具有Tets的表型。只要將它們塗布在含四環素的選擇性培養基平板上，就可以迅速地辨別出它們到底屬於什麼表型。因為在tetr基因內沒有插入外源DN***段的pBR322質粒，其tetr基因是有活性的，由它轉化來的Ampr轉化子菌落就應該是Tetr的表型，所以AmprTets表型的細胞所攜帶的pBR322，必定是在其tetr基因上插入了外源DNA的pBR322派生的重組質粒。
pBR322質粒載體的第三個優點是，具較高的拷貝數，而且經過氯黴素擴增之後，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
2．pUC質粒載體
pUC載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5，—端帶有一段多克隆位點的lacZ'基因，而發展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。
(1) pUC質粒載體的結構
此類質粒載體之所以取名為pUC，是因為它是由美國加利福尼亞大學University of California的科學家J．Messing和J．Vieria於1987年首先構建的。
一種典型的pUC系列的質粒載體，包括如下四個組成部分：
（a）來自pBR322質粒的復制起點(ori)；
（b）氨苄青黴素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已經發生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點；
(c) 大腸桿菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α—肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ'基因；
（d）位於lacZ'基因中的靠近5」端的一段多克隆位點(MCS ，multiple cloning sites)區，但它並不破壞該基因的功能(圖)。(2)pUC質粒載體的優點
與pBR322質粒載體相比，pUC質粒載體系列具有許多方面的優越性，是目前基因工程研究中最通用的大腸桿菌克隆載體之一。其優點概括起來有如下三個方面：
第一、 具有更小的分子量和更高的拷貝數
在pBR322基礎上構建pUC質粒載體時，僅保留下其中的氨苄青黴素抗性基因及復制起點，使其分子大小相應地縮小了許多，如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp。同時，由於偶然的原因，在操作過程中使pBR322質粒的復制起點內部發生了自發的突變，導致rop基因的缺失。由於該基因編碼的共63個氨基酸組成的Rop蛋白質，是控制質粒復制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC質粒的拷貝數比帶有pMBl或ColEl復制起點的質粒載體都要高得多，平均每個細胞即可達500～700個拷貝。所以由pUC質粒重組體轉化的大腸桿菌細胞，可獲得高產量的克隆DNA分子。
第二，適用於組織化學方法檢測重組體
pUC質粒結構中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ，基因，在這個基因的編碼區中插入了一個多克隆位點。lacZ，基因所編碼的α—肽鏈（編碼β—半乳糖酶基因的氨基末端）可參與α—互補作用。這種載體適合於可編碼β—半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。雖然質粒和宿主編碼的片段各自均無活性，但它們共處一個細胞中時可融為一體，形成具有酶學活性的蛋白質。這樣，LacZ基因上缺失近操縱基因區段的突變株與帶有完整近操縱基因區段的β—半乳糖苷酶陰性的不同突變株之間實現互補，這種互補現象叫做α—互補。由α—互補而產生的Lac+細菌易於識別，在誘導物異丙基—β—D—硫代半乳糖苷(IPTG)存在時，它們在含有生色底物5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)的平板上形成藍色的菌落。當多克隆位點中插入外源DN***段時，互補作用遭到破壞，在含有IPTG和X-gal平板上將出現白色菌落。利用「α—互補」進行重組子的篩選比利用「插入失活」法更加方便。應用pBR322質粒作克隆載體，其重組體轉化子克隆的選擇則需經過兩個步驟，即還需從頭一種抗性平板轉移到另一種抗性平板。由此可見，使用pUC質粒載體進行基因克隆要比pBR322節省時間。
第三，具有多克隆位點MCS區
pUC質粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點，它可以在這兩類載體系列之間來回「穿梭」。因此，克隆在MCS當中的外源DN***段，可以方便地從pUC質粒載體轉移到M13mp8載體上，進行克隆序列的核苷酸測序工作。同時，也正是由於具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端(如EcoRI和BamHI的外源DN***段，無需藉助其它操作而直接克隆到pUC質粒載體上。
3. pGEM系列載體
pGEM系列載體是一種與pUC系列十分類似的小分子的質粒載體。在其總長度為2 743bp的基因組DNA中，編碼有一個氨苄青黴素抗性基因和一個lacZ'基因。在後者還插入了一段含多個限制性內切酶的識別序列的多克隆位點。此序列結構幾乎與pUC克隆載體的完全一樣。
pGEM系列載體與pUC系列之間主要差別是，它具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們為RNA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。由於這兩個啟動子分別位於lacZ'基因中多克隆位點區的兩側(見圖)，故若在反應試管中加入純化的T7或SP6RNA聚合酶，那麼克隆的外源基因便會轉錄出相應的mRNA。
三、λ噬菌體載體
l．λ噬菌體的一般生物學特性
λ噬菌體為線形雙鏈DNA分子，長度約為49kb，在λDNA分子兩端各有12個鹼基的單鏈互補粘性末端，當λ噬菌體進入細菌細胞後，其DNA可迅速通過粘性末端配對而成雙鏈環狀DNA分子，這種由粘性末端結合形成的雙鏈區域稱為cos位點。
λ噬菌體是一個溫和噬菌體，其生活周期有二種不同的類型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌體的DNA分子一旦注入寄主細胞中，便可藉助於寄主的復制和轉錄系統的功能，使自身DNA大量復制同時合成大量的外殼蛋白，並組裝成大量(約100個)完整的噬菌體顆粒，最後，使宿主裂解並從細胞中釋放出來。
在溶源周期中，λ噬菌體的DNA分子進入宿主後並不馬上復制，而是在特定的位點整合到宿主染色體DNA中，與宿主染色體形成一體，並隨宿主染色體的復制而復制，隨宿主的分裂繁殖傳給其子代細胞。
λDNA至少包括61個基因，除少數例外，大多數編碼基因均是按功能的相似性成簇排列。值得注意的是，在入λDNA分子中從J基因到N基因之間，大約占λDNA總長度三分之一的區段對於λ噬菌體的裂解周期而言是非必需的。這一區段的缺失或在此段插入外源DN***段，將不影響入噬菌體的增殖。這就是λ噬菌體可作為基因工程載體的一個重要的依據。
2．λ噬菌體載體
（1）改造
野生型的λ噬菌體不適於直接用作基因克隆的載體。主要原因有二：
①λDNA基因組大而且復雜，特別是其中具有許多基因克隆常用的限制酶識別位點(如5個BamHI位點、6個BglⅡ位點和5個EcoRI位點等)；
②λ噬菌體外殼只能接納一定長度(即相當於入基因組大小的75％～105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作為小片段外源DNA分子(即2．5kb左右)的克隆載體。這一克隆容量顯然不能滿足大多數基因克隆工作的要求，必須對野生型λDNA進行改造。
擴充λDNA載體的克隆容量是改造λDNA的首要目標；此外改造工作還包括：①除去裂解周期所必需的基因區域中的限制酶識別位點，在非必需區引入合適的限性酶位點；②引入適當的選擇性標記以方便重組子的篩選；⑧通過在某些必需基因中引入無義突變使之成為安全載體，以利於生物學防護等。
（2）載體類型：
只具有一個限制酶位點可便於外源DNA插入的稱為插入型載體，含有二個限制酶切點，在兩個位點之間的DNA區段可以被外源DN***段所取代的載體稱為取代型載體。
隨著體外包裝技術和寡聚核苷酸合成技術的發展，人們已經構建了許多帶有多克隆位點的λ噬菌體載體，現在常規使用的λ噬菌體載體，不少既可用作插入型又可用作置換型。總之，多克隆位點的引入不僅極大地擴展了λ噬菌體的克隆范圍，同時還大大地簡化了其操作技術。
（3）重組體的篩選
λ噬菌體是利用插入失活或噬菌斑形成的原理篩選重組體的。常用的插入失活方法有大腸桿菌β—半乳糖苷酶失活和免疫功能失活兩種。
利用β—半乳糖苷酶插入失活的載體(如λgt ll、λgt l8—23等)，在生色底物(X—gal)和誘導物(1PTG)存在時，與相應的Lac—宿主鋪平板可形成深藍色噬菌斑。用這種載體進行克隆時，β—半乳糖苷酶基因的大部分被外源DN***段取代，所產生的重組噬菌體喪失α—互補能力，在含有X-gal和IPTG的平板下形成無色噬菌斑。因此，對於這類入噬菌體載體，可通過組織化學方法進行重組子的篩選。
在免疫功能插入失活型載體的基因組中與免疫功能有關的DNA區段中含有一、二種限制酶的單一切點，當外源DN***段由這些位點插入時，就會使載體所具有的合成活性阻遏物的功能遭到破壞，而無法進入溶源周期。因此，凡帶有外源DN***段的重組體只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本則形成混濁的噬菌斑，不同的噬菌斑形態可作為篩選重組體的標志。這種類型的載體中的λgtl0最為常用。
3．λ噬菌體載體的應用
λ噬菌體作為克隆載體主要用於：
（1）基因組DNA文庫的構建；
（2）cDNA文庫的構建
（3）大容量載體(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亞克隆等。
四、 粘粒載體（柯斯質粒載體）
1．柯斯質粒載體的構建
λ噬菌體克隆外源DNA的能力，雖說其理論上的極限值可達23kb，但事實上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。當然，在一般的情況下，這樣大小的DN***段已足夠容納一個完整的基因及其兩端的側翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究資料表明，許多基因的分子大小比正常預期的要大得多，有的可達35～40kb甚至更大。同時，應用λ噬菌體作載體，還往往不能夠同時克隆兩個連鎖的基因。不言而喻，在實際的研究工作中，特別是有關真核基因的結構與功能的研究，需要比λ噬菌體載體具有更大克隆能力的新型的載體。1978年，J．Collins及B．Hohn等人發展出的柯斯質粒載體(eosmidvectors)滿足了這樣的需要。
「cosmid」一詞是由英文「cos site-carrying plasmid"縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點(cos)的質粒。因此我們說，所謂柯斯質粒，乃是一類由人工構建的含有且DNA的COS序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。它們兼具有λ噬菌體的高效感染能力和質粒易於克隆選擇的優點，既能像質粒一樣在寄主細胞內復制，也能像λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。其克隆能力為31—45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。
2．柯斯質粒載體的特點
目前已經在基因克隆通用的質粒載體的基礎上，發展出了許多不同類型的柯斯質粒載體，柯斯載體的特點大體上可歸納成如下三個方面：
第一，具有λ噬菌體的特性。柯斯質粒載體在克隆了合適長度的外源DNA，並在體外被包裝成噬菌體顆粒之後，可以高效地轉導對立噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之後的柯斯質粒DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環化起來。但由於柯斯質粒載體並不含有且噬菌體的全部必要基因，因此它不能夠通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。
第二，具有質粒載體的特性。柯斯質粒載體具有質粒復制子，因此在寄主細胞內能夠像質粒DNA一樣進行復制，並且在氯黴素作用下，同樣也會獲得進一步的擴增。此外，柯斯質粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。例如，在pHC79柯斯質粒基因組的PstI限制位點克隆，會導致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位點克隆，又會造成tetr基因的失活。
第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯質粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和COS位點等三個組成部分，其分子量較小，一般只有5～7kb左右。因此，可以插入到柯斯質粒載體上並能被包裝成立噬菌體顆粒的最大外源DN***段，即柯斯質粒載體的克隆極限可達45kb左右。這個數字比且噬菌體載體及質粒載體的最大克隆能力都要大得多。同時，由於包裝限制的緣故，柯斯質粒載體的克隆能力還存在著一個最低極限值。如果用作克隆載體的柯斯質粒的分子為5kb，那麼插入的外源DN***段至少得有30kb長，才能包裝形成具感染性的且噬菌體顆粒。由此可見，柯斯質粒克隆體系用於克隆大片段的DNA分子特別有效。
目前，已有多種柯斯質粒載體可用於基因克隆，圖所示為最常用的柯斯質粒載體之一pJB8。
粘粒載體功能與λ噬菌體類似，但由於λ噬菌體具有較大的多功能性和較高的克隆效率，仍然是目前構建基因文庫時首選的克隆載體，粘粒載體只有在以下兩種特定的情況下使用：①在單個重組體中克隆和增殖完整的真核基因；②克隆與分析組成某一基因家族的真核DNA區段，即當載體克隆容量大具有明顯優勢時使用粘粒載體。
我查的
『柒』 根據目的基因構建重組質粒的步驟
（1）用限制酶將質粒切割開形成黏性末端，用DNA連接酶將目的基因與質粒連接起來． （2）質粒的實質是環狀DNA，基本組成單位是脫氧核苷酸；由圖中限制酶切割位置可知，目的基因插入的位置是氨苄青黴素抗性基因中． （3）步驟③是基因工程第三步：將目的基因導入大腸桿菌（受體細胞）．為了促進該過程，用Ca 2+ 處理大腸桿菌，使之成為感受態細胞． （4）培養基C是選擇培養基，培養基中有四環素，專一篩選含四環素抗性基因的大腸桿菌，能在C中生長的大腸桿菌有兩種，分別是含有抗四環素基因、同時抗四環素基因和含氨苄青黴素基因的大腸桿菌． （5）D培養基中大腸桿菌能抵抗四環素和含氨苄青黴素，而E中只抗一種四環素，所以在E中對應區域（D中沒有菌落的部位），該處為轉基因大腸桿菌，結果如圖： 故答案為： （1）限制酶 DNA連接酶 （2）脫氧核苷酸 氨苄青黴素抗性 （3）將重組質粒（目的基因）導入大腸桿 菌（受體細胞） Ca 2+ （4）2 （5）E 如下圖所示（兩點全圈出給分）． （1）限制酶 DNA連接酶 （2）氨苄青黴素抗性 （3）將重組質粒導入大腸桿菌（受體細胞） Ca 2+ （4）含四環素抗性基因的大腸桿菌 2 （5）E
『捌』 目的基因與載體的連接產物塗布於平板後由什麼篩選出轉化子/非轉化子
用於基因工程的許多質粒載體含有編碼抗生素抗性的基因，如pBR322攜帶有氨苄青黴素抗性基因（amp）和四環素抗性基因（tet）。這些基因作為載體的標記，其中一個（如amp）可以用來選擇轉化子。因轉化子能在含有抗生素的瓊脂糖培養基上形成菌落，而非轉化的細胞被殺死。另一個基因（如tet）可以用作重組的質粒載體的標記，因為目標序列插入此基因導致插入失活。因此，用重組質粒轉化的細胞僅對amp有抗性，而環狀（天然）質粒轉化的細胞對amp和tet都有抗性。
區分這兩類轉化體的一種方法是使用復制平板：
轉化體首先放在含氨苄青黴素的瓊脂培養基的培養皿上生長，過夜培養後，兩種類型的細菌均會產生單一的菌落。
2. 將一張無菌茸板輕輕壓在培養皿表面，使一些細胞轉移到板上。
3. 將板上的細菌接種在含有四環素的瓊脂培養基上（即一個復制平板）：任何僅能在第一個平板上生長的菌落一定來源包含有重組質粒的細胞。這些菌落可用於篩選特定的目的DNA（如使用免疫技術）。
PUC系列質粒比pBR322系列質粒的應用更廣泛，這種質粒具有以下優點：
拷貝數：每個細菌細胞中存在著幾千個相同拷貝的質粒，提高了質粒DNA的產量。
2. 重組子的「一步選擇」：這種質粒攜帶有氨苄青黴素抗性基因，並在β-半乳糖核苷酶的基因含有一個多克隆位點。β-半乳糖核苷酶基因的插入失活可以被包含有一種合適的酶誘導物（如異丙醇基硫代半乳糖苷）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（Xgal）的瓊脂培養基檢測到。來源於有質粒的細胞的菌落呈藍色，而含有重組分子的菌落呈白色。另有一些質粒使用不同的標記物，如熒光素酶基因可以在熒光素底物的存在下通過生物發光檢測到。